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Nature Biomedical Engineering (2023)Citer cet article 3609 Accès 110 Détails d'Altmetric Metrics Un test de plaque - la méthode de référence pour mesurer la concentration de lytique compétent pour la réplication

Nature Biomedical Engineering (2023)Citer cet article

3609 Accès

110 Altmétrique

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Un test sur plaque, la méthode de référence pour mesurer la concentration de virions lytiques compétents pour la réplication, nécessite une coloration et généralement plus de 48 heures d'exécution. Nous montrons ici que l’imagerie holographique sans lentille et l’apprentissage profond peuvent être combinés pour accélérer et automatiser le test. Le dispositif d'imagerie compact capture les informations de phase sans étiquette à un rythme d'environ 0,32 gigapixels par heure et par puits, couvre une superficie d'environ 30 × 30 mm2 et une plage dynamique de concentration virale 10 fois plus grande que les tests standard, et quantifie les infectés. superficie et le nombre d’unités formant des plaques. Pour le virus de la stomatite vésiculeuse, le test automatisé de plaque a détecté les premiers événements de lyse cellulaire provoqués par la réplication virale dès 5 heures après l'incubation, et en moins de 20 heures, il a détecté des unités formant des plaques à des taux supérieurs à 90 % à 100 % spécificité. En outre, il a réduit le temps d'incubation du virus de l'herpès simplex de type 1 d'environ 48 heures et celui du virus de l'encéphalomyocardite d'environ 20 heures. Le test sans coloration devrait pouvoir être utilisé dans la recherche en virologie, le développement de vaccins et le diagnostic clinique.

Les infections virales peuvent toucher des millions de personnes dans le monde par le biais de maladies infectieuses telles que la grippe, le virus de l'immunodéficience humaine et le virus du papillome humain1. Les Centers for Disease Control and Prevention des États-Unis estiment que depuis 2010, le virus de la grippe a entraîné 16 à 53 millions de cas de maladie, 0,2 à 1 million d’hospitalisations et 16 700 à 66 000 décès rien qu’aux États-Unis2,3. En outre, la pandémie de COVID-19, qui a provoqué plus de 500 millions d’infections et plus de 6 millions de décès dans le monde, pèse lourdement sur la santé publique et le développement socio-économique de nombreux pays4. Pour aider à relever ces défis de santé mondiale, des techniques précises et peu coûteuses de quantification des virus doivent être développées pour le diagnostic clinique5, le développement de vaccins6 et la production de protéines recombinantes7 ou d’agents antiviraux8,9.

Développé en 1952, le test sur plaque a été la première méthode de quantification des concentrations virales. Avancé par Renato Dulbecco, le test permet de déterminer manuellement le nombre d'unités formant des plages (PFU) dans un échantillon donné contenant des virions lytiques compétents pour la réplication10,11. Ces échantillons sont dilués en série et des aliquotes de chaque dilution sont ajoutées à une boîte de cellules en culture10. Au fur et à mesure que le virus infecte les cellules adjacentes et se propage, une plaque se forme progressivement, qui peut être inspectée visuellement par un expert. En raison de sa capacité unique à fournir le pouvoir infectieux des échantillons viraux de manière rentable, le test sur plaque reste la méthode de référence pour quantifier les concentrations virales, malgré l'existence d'autres méthodes12,13,14,15,16,17. ,18,19, tels que les tests de formation focale d'immunofluorescence14, la réaction en chaîne par polymérase16 et les tests basés sur des tests immunoenzymatiques19,20. Cependant, les tests de plaques nécessitent généralement une période d'incubation de 2 à 14 jours (en fonction du type de virus et des conditions de culture)21 pour permettre aux plaques de se développer jusqu'à des tailles visibles et sont sujettes à des erreurs humaines lors du processus de comptage manuel des plaques22. Pour améliorer les tests de plaque traditionnels, de nombreuses méthodes ont été développées23. Bien que de nombreux systèmes aient des capacités uniques pour imager les cultures cellulaires dans des plaques à puits, ils nécessitent soit des marqueurs de fluorescence22, soit des plaques de culture spéciales dotées de microélectrodes en or24. De plus, les erreurs de comptage humaines restent un problème pour ces méthodes. Un test de plaque précis, quantitatif, automatisé, rapide et rentable serait donc avantageux pour la recherche en virologie et les applications cliniques associées.

Certains des développements récents en matière d’imagerie de phase quantitative (QPI), d’holographie et d’apprentissage profond offrent l’opportunité de répondre à ce besoin. QPI est une technique d'imagerie prédominante qui permet la visualisation et la quantification d'échantillons biologiques transparents de manière non invasive et sans étiquette25,26. De plus, la qualité d’image des systèmes QPI peut être améliorée à l’aide de réseaux de neurones en améliorant notamment la récupération de phase27, la réduction du bruit28, la mise au point automatique29,30 et la résolution spatiale31. En outre, de nombreuses méthodes de détection et d’identification de micro-organismes basées sur l’apprentissage profond ont été présentées à l’aide de QPI32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42.

90% PFU detection rate in <20 h, providing major time savings compared with the traditional plaque assays, which take ≥48 h. Furthermore, we show an average incubation time saving of ~48 h and ~20 h for HSV-1 and EMCV, respectively, achieving a PFU detection rate >90% with 100% specificity. A quantitative relationship was also developed between the incubated virus concentration and the virus-infected area on the cell monolayer. Without any extra sample-preparation steps, this deep-learning-enabled label-free PFU imaging and quantification device can be used with various plaque assays in virology and might help to expedite research in vaccine and drug development./p>95% coverage. During the virus infection, five wells were infected by 100 µl of the diluted VSV suspension (obtained by diluting a 6.6 × 108 PFU ml−1 VSV stock with a dilution factor of 2−1 × 10−6), and one well was left for negative control. Then, 2.5 ml of the overlay solution containing the total medium with 4% agarose was added to each well (see Methods for details, ‘Preparation of agarose overlay solution’). After the solidification of the overlay at room temperature, each sample was first placed into our imaging set-up for 20 h of incubation, performing time-lapse imaging to capture the spatiotemporal information of the sample. Then, the same sample was left in the incubator for an additional 28 h to let the PFUs grow to their optimal size for the traditional plaque assay (this is only used for comparison purposes). Finally, each sample was stained using crystal violet solution to serve as the ground truth to compare against our label-free method./p>90% at 20 h of incubation without having any false positives at any time point despite using no staining./p>1%), a faster PFU concentration readout can be provided at 12 h or 15 h. As the size of an average PFU on the well is physically larger at 15 h of incubation compared with 12 h, the slope of the red calibration curve in Fig. 6b is smaller than in Fig. 6a, as expected. For samples with even higher virus concentrations, the infected cell area percentage could reach >1% in ≤10 h of incubation (shown in Fig. 5c), providing the PFU concentration readout even earlier./p>70 °C during its operation, which could disturb the growth of the sample and vaporize the agarose layer, especially for regions that are near the sensor parking location between successive holographic scans. Hence, a cooling system was built using fans (QYN1225BMG-A2, Qirssyn). We also sealed the sides of the sample using parafilm (product number 13-374-16, Fisher Scientific) and opened four holes on the top cover to form a gentle ventilation system, which is an inexpensive and easy-to-implement solution to avoid sample drying./p>90% detection rate for VSV PFUs with 100% specificity in <20 h./p>11 TB) is available from the corresponding author on reasonable request./p>